PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0473

Valorificarea reziduurilor agroalimentare prin solutii nutritionale de contracarare a contaminantilor prezenti in furaje

Context : Schimbările climatice din ultimii ani și activitățile industriale au crescut riscul contaminării cerealelor si furajelor destinate animalelor de fermă cu diferiți contaminanți (de la metale grele, pesticide, compuși organofluorurați până la microorganisme, fungi, micotoxine, etc). Pentru contracararea efectelor lor negative pe piața agro-industrială există numeroase produse al căror preț este însă ridicat ceea ce duce la o creștere a costului total al ponderii hranei în economia fermei. De aceea, găsirea de soluții mai ieftine este imperios necesară. Reziduurile provenite din industria agroalimentară reprezintă surse importante de compuși bioactivi (polifenoli, acizi grași polinesaturați-PUFA, fibre, vitamine, minerale etc) care ar putea reduce efectele contaminanților prin adsorbție fizică directă sau prin alte mecanisme (biotransformare / imunostimulare). Câteva studii preliminare in vitro au demonstrat acest lucru.

Obiectivul proiectului este de a obține noi rețete si produse furajere imbogățite in compuși bioactivi eficiente in reducerea efectelor contaminanților la animalele de fermă, prin reciclarea reziduurilor agroalimentare (RA). Utilizarea lor poate avea mai multe avantaje: reducerea nivelului de contaminare a furajelor, îmbunătățirea sănătații animalelor de fermă, evitarea poluării cu reziduuri si protecția mediului, creștere economică prin reducerea costurilor in ferme (achiziția de produse decontaminante) etc.

Activitati prevazute. Proiectul este structurat in 4 etape și 16 activități care urmăresc screeningul si selecționarea unor reziduuri cu potențial crescut in adsorbția si contracararea contaminanților, în special micotoxine, testarea lor in experimente in vitro si in vivo si demonstrarea eficientei produselor furajere in scopul brevetării. Se va obține un aditiv furajer si un produs furajer (nutreț combinat) destinat porcinelor, bogate in compuși bioactivi, cu rol de contracarare a contaminanților din furaje.

Etapa 1. Procurarea si caracterizarea fizico-chimica a reziduurilor agroalimentare cu potențial decontaminant

Deşeurile din legume şi fructe sunt o sursă importantă de compuşi antioxidanţi, acizi organici, vitamine, carbohidraţi, substanţe minerale şi fibre. În cadrul proiectului au fost selectate deşeuri din legume şi fructe pentru a fi utilizate ca potenţiali decontaminanţi pentru micotoxinele din furajele destinate animalelor. Deșeurile testate au fost reprezentate de reziduuri de coaja și pulpă provenite din trei varietăți de măr (măr Roşu delicios, măr Golden, măr Granny Smith), morcov, ţelină și sfeclă, precum și coji de cartof, pepene galben, pepene verde și un șrot de semințe de struguri. Caracterizarea acestor reziduuri a fost făcută de coordonatorul proiectului component 1 (IBNA) și de partenerul UBB. Probele liofilizate de măr, morcov, țelină, sfeclă, coaja de cartof și pepene și șrotul de semințe de struguri au fost analizate privind compoziția chimică brută și s-a observat o mare diversitate în ceea ce privește conținutul în proteină, grăsime, minerale și fibre. Probele analizate nu au fost contaminate cu micotoxine. In aceste probe au fost analizați compușii bioactivi din deșeuri - compuşi antioxidanţi (polifenoli, acizi fenolici, etc.), vitamina C, acizii organici şi carbohidraţii. Datorită prezenţei acestor compuşi biologic activi, probele studiate reprezintă produse secundare valoroase, cu potenţială aplicare la decontaminarea furajelor contaminate cu micotoxine.
In continuare s-a realizat evaluarea efectului de adsorbant al micotoxinelor pentru reziduurile agroalimentare care au fost caracterizate in activitățile anterioare în ceea ce privește capacitatea lor de reducere a contaminării cu micotoxine. Două micotoxine (aflatoxina și zearalenona), care contaminează frecvent cerealele în Romania, au fost alese pentru selecția reziduului/reziduurilor promițătoare în ce privește capacitatea de decontaminare. Coaja de cartof a demonstrat cea mai mare capacitate de absorbție atât pentru AFB1 cât și pentru ZEA, atât în cazul varierii timpului de incubare cât și a cantității de reziduu. Reziduurile de mere, morcov, sfeclă și țelină au avut o capacitate mai mică de adsorbție a micotoxinelor. Indiferent de tipul de reziduu există o mică variație a adsorbției indiferent de tipul de pH in ceea ce privește capacitatea de legare a AFB1. In schimb capacitatea de legare a ZEA pare a fi afectată mai mult de variațiile pH-ului, adsorbția toxinei crescând o dată cu pH-ul in cazul cojilor de cartof sau scăzând pe măsura ce pH-ul devine mai bazic (țelină, morcov, șrot semințe struguri, măr Golden).
Pentru studiile de docking, a fost generată o structura tridimensionala folosind soft-ul CarbBuilder 2.1.17 care a fost analizata vizual pentru identificarea potențialelor conflicte sterice si supusa unei etape de minimizare, folosind câmpul de forța nereactiv UFF, integrat in ArgusLab. Din studiile de docking a reieșit ca AFB1 sau ZEA nu par sa aibă o afinitate preferențiala fata de anumite unități sau conformații monozaharidice.
In continuare, in anul 2019, sunt prevazute 2 etape: Etapa 2.1-Dezvoltarea unui model experimental in vivo la porc pentru investigarea si testarea eficientei si funcționalității produselor obținute: aditiv furajer si nutreț combinat cu potential decontaminant imbogatit in compusi bioactivi și Etapa 3.1 Verificarea potentialului decontaminant al reziduurilor in conditii de co-contaminare simultana fungica (micotoxina), virala si microbiana (model simulare in vitro) în care vor fi testate in vitro și in vivo cele mai promițătoare reziduuri analizate in Etapa 1.
 

Utilizare cecuri

In PC1 au fost utilizate in anul I al proiectului (2018) doua cecuri de mobilitate tip B - Mobilități pentru - vizite de lucru ale cercetătorilor cu experiență in scopul prezentarii rezultatelor obținute din derularea activitatilor comune desfasurate de CO si P1 corespunzatoare planului de realizare pentru anul 2018 si al stabiliri modului de desfasurare a activităților pentru anul 2019 pentru proiectul component PC1.

 

Etapa 2. Dezvoltarea unui model experimental in vivo la porc pentru investigarea si testarea eficientei si funcționalității produselor obținute: aditiv furajer si nutreț combinat cu potențial decontaminant îmbogățit in compuși bioactivi

In această etapă am analizat efectul anti-micotoxic al unor reziduuri din industria alimentara (șrot de semințe de cătină și șrot de semințe de struguri) in experimente in vivo și in vitro la porc.

Rezultatele obținute în experimentele in vivo au arătat:

• O creștere semnificativă a răspunsului inflamator la nivelul ficatului ca rezultat al intoxicației cu aflatoxina B1 (AFB1) pentru citokinele inflamatorii: IL-1 beta, IL-6, TNF-a, IL-17A, GM-CSF și a a expresiei chemokinelor: CXCL-8, CCL-1, CCL-2, CCL-4, CCL-5, CCL-10 și CCL-24
• o creștere a expresiei genice pentru CYP4A24 și GSTA1 indusa la nivel hepatic de intoxicatia simultană cu AFB1+OTA (ochratoxină)
• șrotul de semințe de struguri a determinat o scădere semnificativă a răspusului inflamator indus de aflatoxină
• în ganglioni, AFB1 a determinat o scădere semnificativă a activității catalazei (CAT, superoxid dismutazei (SOD) a glutathion peroxidazei (GPx) și o creștere semnificativă a peroxidării lipidice
• activitatea antioxidantă afectată de intoxicația cu AFB1 a fost restabilită in ganglionii purceilor înțărcați intoxicați cu AFB1 cărora le-a fost administrat nutreț combinat care conține șrot de semințe de struguri
• in splina, o scădere a activității catalazei a fost observata in splină asociată cu o creștere a SOD si TCA și TBARS consecutive intoxicației cu AFB1
• administrarea concomitentă a șrotului cu AFB1 a determinat o restabilirea parametrilor afectați de AFB1 la nivelul controlului în splina purceilor înțărcați

 

Activitatea 2-1. Dezvoltare model viral; testare in vitro a eficacitatii extractelor de reziduuri  in cazul  unei co-contaminari  virale si micotoxice (continuare 2019)

A fost analizat efectul antiviral al extractului de struguri (GE) in prezenta sau absenta AFB1 asupra virusului diareei bovine (BVDV) in sistem abiotic sau in culturi de celule MDBK (Madine Darby Bovine Kidney).   GE a avut un puternic efect antiviral (90% inhibitie), semnificativ statistic, atunci cand a fost administrat post-infectie, sugerand un mecanism de actiune post-internalizare, cel mai probabil la nivelul  replicarii virale.

In studiile de viabilitate celulara, rezultatele obținute arata un posibil rol protector al GE, fata de efectul nociv al AFB 1, destul de redus (15-20%), dar statistic semnificativ, indiferent de diluția de GE folosita, atunci când extractul este administrat ca metoda de prevenție (tratare 24h înainte de expunerea la AFB1). Datele sugerează, de asemenea, ca mecanismele moleculare prin care este indusa toxicitate celulara in urma expunerii la AFB, ar putea fi diferite de cele induse de infecția citopatica cu BVDV, cel puțin in cazul celulelor MDBK.

 

Activitatea 2-2. Studii analitice (-omics) pentru identificarea efectelor hepatotoxice si nefrotoxice induse de contaminanți si a capacității de contracarare a reziduurilor (toxicogenomica; toxicoproteomica, toxicometabolomica)

 Studiile noastre la purcei expuși la micotoxine si care au consumat sau nu furaj cu amestec de șroturi au evidențiat modificări ale expresiei proteice în funcție de dietă. În cazul ficatului s-a înregistrat o creștere a expresiei proteice pentru CYP2E1, CYP3A4 și GSTA1, în cazul loturilor în care furajul a fost suplimentat doar cu amestec de micotoxine (E2) comparativ cu lotul control, însă pentru CYP1A2 efectul este total opus, în care lotul E1 prezintă expresie mai mare față de lotul control.

La nivelul rinichiului cele mai semnificative modificări se remarcă pentru în care s-a observat că în cazul purceilor care au fost hrăniți cu o dietă contaminată cu micotoxine și care conține amestecul de șroturi este reglat semnificativ nivelul de expresie al CYP1A2, CYP2E1 și GSTA1 față de lotul de purcei expuși la micotoxine. Totodată, se remarcă, ca și în cazul ficatului, o creștere a expresiei proteice pentru CYP3A4 în cazul lotului de purcei care au consumat o dietă contaminată cu micotoxine comparativ lotul control. În plus, activitatea specifică GST confirmă nivelul de expresie proteică observat pentru GSTA1.

 

Etapa 3. Verificarea potențialului decontaminant al reziduurilor in conditii de co-contaminare simultana fungica (micotoxina), virala si microbiana (model simulare in vitro)

 

Rezultatele obținute în experimentele in vitro au arătat că:

• extractul de semințe de struguri are un efect puternic antiviral in vitro, in culturi de celule bovine MDBK, în prezenta și in absenta contaminării cu AFB1
• extractul de seminte struguri a fost cel mai eficient in inhibarea virusului BVDV (95% inhibitie)
• AFB1 a indus o inhibare moderata a productiei de virus BVDV, de pana la 50%
• extractele au determinat inhibiția creșterii bacteriilor patogene având o activitate inhibitorie similara pentru inhibarea creșterii aureus si E. fecalis;
• extractul de seminte de struguri a fost foarte eficient in inhibarea acțiunii inflamatorii combinate a toxinelor (ZEA sau OTA) și a bacteriilor (LPS), inhibând sinteza de citokine inflamatorii: IL-6, TNF-alpha, IL-1beta
• pentru șrotul de cătină efectul a fost moderat anti-inflamatoriu; doar extractul de seminte de struguri a determinat o creștere semnificativă a capacității antioxidante

 

Etapa 4. Validarea eficientei produsului furajer obținut prin utilizarea unui model experimental de toxicocinetică intr-o ferma experimentala  

Experimentul a fost realizat in ferma experimentala a IBNA pe 40 de purcei hibrizi TOPIG înțărcați (10 purcei/lot) cu o greutate medie iniţială de  9,13 ± 0.05 kg, timp de 30 de zile. După înțărcare (la 30 de zile) purceii au fost aclimatizaţi în hala experimentală timp de o săptămână înainte de a fi utilizaţi in protocolul experimental si au fost tratati cu colistin (3 zile) pentru a preveni stresul de înțărcare. Animalele au fost repartizate in patru loturi :  Control, ochratoxină A (OTA), amestec șroturi -șrot cătină+ șrot semințe struguri (SSC), ochratoxină A + amestec șroturi (SSC+OTA). La sfârșitul experimentului (30 zile) au fost recoltate probe de sânge și organe (ficat și rinichi) pentru determinări analitice.

Ingerarea NC-lui contamint cu OTA timp de 30 de zile a determinat o creștere a concentrației de OTA de 14,81 ori față de concentrația de OTA din ficatul de la animalele control. Important de remarcat este fapul că administrarea furajului care a conținut amestecul de șroturi a condus la o reducere a concentrației de OTA cu 72% față de concentrația de OTA determinată în ficatul purceilor intoxicați. Așa cum era de așteptat, concentrația de OTA în ficatul purceilor din lotul SSC, a avut un nivel similar cu cel identificat la lotul control. Administrarea nutrețului combinat contaminat cu OTA timp de 30 de zile a determinat o creștere a concentrației de OTA de 46 ori față de concentrația OTA din rinichii de la animalele control. Concentrația de OTA în rinichii purceilor din lotul SSC, a fost similară cu cea identificată la lotul control. La fel ca și în cazul ficatului,  administrarea furajului care conține amestecul de șroturi  a determinat o reducere a concentrației de OTA cu 91.3% față de concentrația determinată în rinichii purceilor intoxicați cu OTA.

Aceste rezultate sugerează ca amestecul de șrot de struguri și șrot de cătină precum și nutrețul combinat incluzând aceste subproduse reprezintă o sursa alternativa eficace in contracararea efectelor negative produse de hrana contaminată cu ochratoxină prin scăderea reziduurilor de toxină din ficat și rinichi, organe cu rol cheie în procesele metabolice ale animalelor.  De asemenea nutrețul combinat cu amestec de șroturi are capacitatea de a îmbunătăți statusul imun prin anticorpi. Având în vedere că pentru diminuarea efectelor micotoxinelor în ferme se utilizează doar produse de import, produsul rezultat din acest proiect este un produs românesc, cu eficiență ridicată și preț de cost scăzut care poate fi folosit în hrana purceilor in perioada de înțărcare.

Activitatea 4-1-4: Elaborare unei cereri de brevet pentru brevetarea: aditivului furajer / a unei noi rețete furajere pe bază de reziduuri agroalimentare; parteneri implicati (CO-IBNA, P2-UBB, P3-IBAR); in aceasta activitate a fost elaborata o cerere de brevet (A/00689/2020) pentru o reteta noua de nutreț combinat incluzând un amestec de reziduuri agro-alimentare (șrot de sâmburi de struguri si șrot de catina) cu efect de reducere a concentrației de micotoxine din organe (ficat și rinichi) la porc. Rețeta a fost transferată la sectorul de dezvoltare al IBNA si la ferme particulare (AgroLaig Prod Serv SRL).

  

Diseminare rezultatelor

 

Lucrari ISI 

1. Marin D. E., Bulgaru C. V., Anghel C. A., Pistol G. C., Dore M. I., Palade M. L, Taranu I. Grape seed waste counteracts the aflatoxin B1 toxicity in piglets mesenteric lymph nodes. Toxins, 2020 12(12), 800; 10.3390/toxins12120800
2. Taranu I., Hermenean A., Bulgaru C, Pistol G.C, Ciceu A., Grosu I.A, Marin D. E. 2020. Diet containing grape seed meal by-product counteracts AFB1 toxicity in liver of pig after weaning. Ecotoxicology and Environmental Safety 203 (2020) 110899
3. Palade L. M., Dore M. I., Marin D.E , Rotar M. C. Assessment of food by-products potential for simultaneous Aflatoxin B1 and Zearalenone binding. Toxins. 2020 Taranu I. Toxins (Toxins, 2021 13(1), 2; https://doi.org/10.3390/toxins13010002)
4. Marin DE., Pistol G. C., Bulgaru C. V., Taranu I. Cytotoxic and inflammatory effects of individual and combined exposure of HepG2 cells to zearalenone and its metabolites. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 2019 Aug;392(8):937-947. doi: 10.1007/s00210-019-01644-z. Epub 2019 Mar 27.
5. Grosu IA, Pistol GC, Taranu I, Marin DE. The Impact of Dietary Grape Seed Meal on Healthy and Aflatoxin B1 Afflicted Microbiota of Pigs after Weaning.Toxins (Basel). 2019 Jan 8;11(1). pii: E25. doi: 10.3390/toxins11010025.
6. Marin D.E., Braicu C., Dumitrescu G., Pistol G. C., Cojocneanu R., Berindan Neagoe I., Taranu I. MicroRNA profiling in kidney in pigs fed ochratoxin A contaminated diet. Ecotoxicology and Environmental Safety 184 (2019) 109637 https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2019.109637
7. Popescu R.G., Bulgaru C., Untea A. , Vlassa M., Filip M., Dinischiotu A., Georgescu S.E. Antioxidants The effectiveness of dietary by-product antioxidants on induced CYP genes expression in piglets fed aflatoxin B1 contaminated diet Toxins, Volume: 13, Issue: 2, Article Number: 148, DOI: 10.3390/toxins13020148
8. Marin D. E., Bulgaru C. V., Anghel C. A., Pistol G. C., Dore M. I., Palade M. L.and Taranu I.. Grape seed waste counteracts the aflatoxin B1 toxicity in piglets mesenteric lymph nodes.Toxins (Basel). 2020 Dec; 12(12): 800.Published online 2020 Dec 15. doi: 10.3390/toxins12120800
9. Taranu I., Hermenean A., Bulgaru C., Pistol GC, Ciceu A., Grosu A. I, Marin D.E. Diet containing grape seed meal by-product counteracts AFB1 toxicity in liver of pig after weaning. Ecotoxicology and Environmental Safety. 203 (2020) 110899.
10. Bulgaru CV, Marin DE, Pistol GC, Taranu I. Zearalenone and the Immune Response. Toxins, 2021 13(4):248; https://doi.org/10.3390/toxins13040248

 Lucrari BDI

1. Marin D. E., Pistol G. C., Gras M., Palade M., Taranu,I. 2018. Effect of Cereal Contaminants on the Inflammation and Oxidative Stress in the Gut of Weanling Piglets Scientific Papers: Animal Science and Biotechnologies, Vol 51, No 1, pp38-42
2. Daniela Marin, Gina Pistol, Mihai Gras, Cătălin Rotar, Ionelia Taranu. 2019.Role of probiotics in counteracting the effect of usual feed contaminants in swine. Scientific Papers-Animal Science Series: Lucrări Ştiinţifice - Seria Zootehnie, vol. 72, 155-160.
3. Marin D.E, Pistol G, Taranu I. 2020. Cytotoxic effects of individual and binary combinations of zearalenone and ochratoxin a on liver. Archiva Zootechnica, vol 23, I, 73-80.
4. Palade LM, Pertea AM, Taranu I. Response of antioxidant status in kidney of pigs fed aflatoxin B1 contaminated diets to grape seed meal supplementation. Archiva Zootechnica vol. 24, nr. 1, pp. 17-31, 2021

Conferinte Internationale

1. Palade, Laurentiu Mihai; Pertea, Ana-Maria; Marin, Daniela Eliza; Grosu, Iulian Alexandru; Stancu, Mariana; Taranu, Ionelia. Comparative efficacy of agricultural byproducts in sequestering aflatoxin B1 and zearalenone: grape seed and seabuckthorn meals. 13th World Congress on Polyphenols Applications. Malta, September 30 - October 1, 2019.
2.  Marin D.E. Palade M.L; Pistol G.C., Taranu I. Effect of concomitant exposure to zearalenone and soybean of CaCo2 cells. 41th Mycotoxin Workshop 2019, 6-8 Mai, Lisbon, Portugal.
3. Palade L.M., Marin D.E., Grosu I. A., Pistol G.C, Taranu I. Preliminary assessment of fiber and polyphenol rich food-derived residues: aflatoxin B1 and zearalenone binding potential. 12th World Congress on Polyphenols Applications: Bonn Polyphenols University of Bonn, Germany, 25 -28.09.2018
4. Marin D.E, Pistol G.C, Taranu I. Individual and combined cytotoxic effects of co-occurring mycotoxins of zearalenone family on HepG2 cells. 40th Mycotoxin Workshop, Munchen, Germany, 11-13.06.2018
5. Marin DE, Palade M, Pistol GC, Taranu I. Effect Of Concomitant Exposure To Zearalenone And Soybean Of Caco2 Cells. 6-8 May, 41st Mycotoxin Workshop, Lisbon, 2019.
6. Vlassa M, Miuța Filip, Virginia Coman, Daniela Marin, Ionelia Țăranu, HPLC characterization of some bioactive compounds from agro-food residues, 25th International Symposium on Separation Sciences Lodz, Poland, 15-18 September 2019.
7. Vlassa M, Miuța Filip, Perhaița Ioana, Prodan Doina, Borodi Gheorghe, Daniela Marin, Ionelia Țăranu Some freeze dried fibre from agro-food residues characterization by physico-chemical, thermal and spectroscopic methods. 15th International Symposium of Animal Biology and Nutrition organized by the National Research-Development Institute for Animal Biology and Nutrition - IBNA Balotești- September 27, 2019 .
8. Vlassa M, Miuța Filip, Perhaița Ioana, Prodan Doina, Borodi Gheorghe, Daniela Marin, Ionelia Țăranu . Physico-chemical, thermal and spectroscopic characterization of some freeze-dried fruit and vegetable waste, used as feed supplement for the reduction of the toxic effect of aflatoxin B1 in swine. The 33rd EFFoST International Conference: Sustainable Food Systems - Performing by Connecting, Wageningen University & Research , Rotterdam, The Netherlands, 12-14 November 2019.
9. Popescu RG, Marin D, Țăranu I, Georgescu S. E., Dinischiotu A Prevention of combined effects of aflatoxin B1 and ochratoxin A by dietary byproduct antioxidants on protein expression of cytochrome P450 enzymes in piglets liver and kidney.42nd Mycotoxin Workshop, Munchen, 2021

Cecuri:

In PC1 a fost utilizat in anul II al proiectului (2019) un cec de mobilitate tip C pentru un tânăr cercetător nou angajat pentru învățarea de noi tehnici de microbiologie.

In PC1 a fost utilizat in anul III al proiectului (2020) un cec de mobilitate tip C pentru un tânăr cercetător nou angajat pentru învățarea de noi tehnici de microbiologie.

 

 

Obtinerea de produse de uz furajer pe baza de resurse neconventionale (proteice) generate de tehnologiile moderne din industria alimentara si biotehnologii – PC 2

 

Obiectivul proiectului constă în obținerea și evaluarea unui produs de uz furajer care va îngloba 2 componente: 1) nutreț combinat complex incluzând resurse alternative și 2) preparat probiotic bacterian.

ACTIUNI/ ETAPE :

Pentru atingerea obiectivului propus se are în vedere:

1. Identificarea unor resurse proteice / oleaginoase mai puțin studiate si caracterizarea nutriționala a acestora.
2. Formularea și obținerea în condiții de laborator a preparatului probiotic (tulpini bacteriene caracterizate fenotipic și molecular, selecționate în funcție de activitatea probiotică; stabilitatea în furaj va fi asigurată prin micro încapsularea produsului bacterian prin tehnici de atomizare). Testarea efectelor acestuia in vitro și in vivo după încorporare în nutreț combinat.
3. Obținerea și validarea prin teste pe purcei și păsări a produsului de uz furajer complex (preparat probiotic și nutreț combinat).
4. Diseminarea rezultatelor cercetării.

ETAPA 1/2018

Identificarea unor resurse proteice / oleaginoase mai puțin studiate si caracterizarea nutriționala a acestora.

Obiectivul etapei: Asigurarea suportului științific și tehnic ca punct de plecare în realizarea eficientă a strategiei de dezvoltare a proiectului.

ACTIVITĂȚI:

• Activitatea 1-1-2. S-a stabilit valoarea nutritivă detaliată a unor surse proteino- oleaginoase disponibile local : mazăre, sorg, boabe de soia, floarea soarelui cu un nivel modificat de proteină (high level). S-a stabilit ponderea de includere în nutrețul combinat.

• Activitatea 1-2-2. Studii analitice privind caracterizarea fenotipică și confirmarea moleculară a unor tupini bacteriene. Realizarea unui catalog cu tulpini bacteriene din probele de conținut intestinal (ileon și cecum) de la puii de găină și purcei.

Tulpinile au fost analizate macroscopic, atât din culturile de pe mediul solid cât și din culturile din mediul lichid. S-a urmărit morfologia, consistenţa, tipul coloniei, conturul coloniei, prezenţa/absenţa unor pigmenţi. Pentru verificarea purităţii, tulpinile bacteriene au fost supuse examinării microscopice prin colorația Gram a frotiurilor din culturi de pe mediu solid și lichid. Caracterele biochimice s-au analizat prin efectuarea testului catalazei. S-a realizat investigarea fermentatiei carbohidratilor pentru identificarea genului si a specie bacteriene și identificarea și investigarea moleculară (qPCR, analiza secvenței genelor 16S ARNr, CO I, cpn 60) a caracterelor probiotice la tulpinile identificate fenotipic.

• Activitatea 1.3.2. Identificarea și investigarea moleculară (qPCR, analiza secvenței genelor 16S ARNr, CO I, cpn 60) a caracterelor probiotice la tulpinile identificate fenotipic.

• Activitatea 1.4.2. Obținerea unui preparat bacterian bazat pe Bacillus subtilis (concentrație 1.6 x 10^9 UFC/ml cultura). Stabilirea protocolului experimental. Studii experimentale preliminare in vitro de determinare a caracterelor probiotice a acestor tulpini.

REZULTATE:

Suport tehnico-științific necesar elaborării setului de recepturi pe specii.

• Catalog tulpini bacteriene din genul Lactobacillus caracterizate fenotipic, izolate de la pui de găină și purcei.

• Preparat bacterian bazat pe Bacillus subtilis (concentrație 1,6 x 10^9 UFC/ml cultura), caracterizat fenotipic și confirmat molecular.

• Tabele cu valori nutritive detaliate la: mazăre, sorg, boabe de soia, floarea soarelui cu un nivel modificat de proteină (high level).

• Variante de recepturi de nutreț combinat pentru purcei.

Comunicari interne

Lavinia Idriceanu. Cercetări privind determinarea digestibilității substanțelor nutritive in vivo și in vitro la suine. IBNA Balotești, prezentare de final de stagiatura, ianuarie 2018.

 

Utilizare cecuri

In PC2 au fost utilizate in anul 2018, 2 cecuri de mobilitate de tip C (Formarea resursei umane nou angajate și pentru înțelegerea de noi tehnici și tehnologii) la partenerul USV Suceava pentru însușirea de metode pentru determinarea calității cărnii.

Etapa 2/2019

Obținerea și validarea  produsului de uz furajer format din 2 componente: nutreț combinat complex și produs bacterian

Obiectivele etapei:

• dezvoltarea protocolului experimental;
• concepția, proiectarea și elaborarea planului experimental;
• selecția de tulpini bacteriene;
• obținerea unui preparat bacterian și caracterizarea acestuia,
• obținerea unui produs furajer cu adaos de preparat bacterian înainte de administrare.

 

Activitatea 2.1.2. Obținere / caracterizare produs din tulpini bacteriene cu activitate probiotică. Cultivarea bacteriilor probiotice selectate și microîncapsularea lor prin tehnici de atomizare.

Activitatea 2.2.2. Stabilirea efectelor a produsului de uz furajer asupra performantelor productive, asupra calităților nutriționale ale cărnii de porc și pasăre .

În etapa 2 s-a obținut, caracterizat, testat in vitro și validat prin teste biologice un produs furajer complex format din nutreț combinat specific speciei si categoriei de vârstă și greutate (păsări și purcei) la care s-a adăugat produsul microbian bazat pe tulpini bacateriene de Lactobacillus caracterizate fenotipic și confirmate molecular.

Produsul microbian microîncapsulat permite păstrarea microorganismelor viabile ȋn concentrație ridicată pentru o perioadă ȋndelungată de timp (6 - 12 luni).

Cercetările desfăşurate în această etapă au condus la obţinerea de rezultate relevante atât din punct de vedere a parametrilor bioproductivi cât şi din punct de vedere a calității senzoriale a cărnii.

Au fost publicate 2 articole, alte 4 articole sunt în recenzie, o comunicare orală și 5 sub formă de poster și s-au depus 2 cereri de brevet.

 DISEMINARE

Articole BDI

1. Grigore D.M , Ciurescu G., Idriceanu I., Mironeasa S., Iuga M, Băbeanu N Effect of low-fiber sunflower meal and phytase addition on broiler carcass traits, and meat quality. Archiva Zootehnică 22(1), 32-47. 2019
2. Dumitru Mihaela, Sorescu Ionuț, Habeanu Mihaela, Tabuc Cristina, Jurcoane Stefana Preliminary characterization in vitro of Bacillus licheniformis strain for used as a dietary probiotic. Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies, Vol. 23, 164-172. ISSN 2285-1364, CD-ROM ISSN 2285-5521, ISSN Online 2285-1372, ISSN-L 2285-1364

Conferinte

1. Târnoveanu Emanuel, Lefter Nicoleta A., Gheorghe Anca, Hăbeanu Mihaela Dietary effects of some not conventional feed ingredients on plasma lipoprotein profile in growing fattening pigs The 15th International Symposium of Animal Biology and Nutrition organized by the National Research-Development Institute for Animal Biology and Nutrition 27 sept, 2019, Balotesti, Romania
2. Târnoveanu Emanuel, Dumitru Mihaela, Hăbeanu Mihaela Changes in the gut microbiota of broiler chickens after Lactobacillus sp. probiotic treatments: a mini-review„ International Scientific Symposium „Modern animal husbandry - Food safety and durable development” Faculty of Animal Sciences, University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, October 17 - 18, 2019, Iasi Romania
3. Dumitru Mihaela, Mihaela Hăbeanu, Ionuț Sorescu, Cristina Tabuc. Effects of Bacillus subtilis use as a dietary probiotic in weaning piglets. European Biotechnology Congress, 11-13 apr 2019, Valencia, Spania.
4. Dumitru Mihaela, Sorescu Ionuț, Ciurescu Georgeta, Tabuc Cristina, Hăbeanu Mihaela, Chelaru Nicoleta-Raluca In vitro probiotic properties of a lactic acid bacteria isolated from a broiler chicken. Symposium " Modern animal husbandry - Food safety and durable development ", Faculty of Animal Sciences, University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, October 17 - 18, 2019, Iasi Romania
5. Raluca Chelaru, Mihaela Dumitru, Ionut Sorescu, Mihaela Habeanu In vitro evaluation of probiotic properties of a lactic acid bacteria isolated from piglet. International Scientific Symposium „Modern animal husbandry - Food safety and durable development” Faculty of Animal Sciences, University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, October 17 - 18, 2019, Iasi Romania

Cereri de Brevete:

1. Dumitru M, Hăbeanu M., Lefter N., Sorescu I., Tabuc C., Gheorghe A., Idriceanu L. Nutreț combinat îmbunătățit prin adaos de aditiv zootehnic bacterian pentru purcei în criza de înțărcare OSIM cerere A/00245 /19.04.2019
2. Gheorghe Anca, Dumitru Mihaela, Ciurescu Georgeta, Lefter Nicoleta, Hăbeanu Mihaela,, Tabuc Cristina, Sorescu Ionuț. Nutreț combinat îmbunătățit prin adaos de probiotic pentru furajarea puilor de carne. Cerere de brevet nr. A/00770 /20.11.2019

ETAPA 3/2020

Efectele produsului bacterian asupra microbiotei bacteriene intestinale a puilor de găină și purceilor si a calitatii senzoriale

Obiectivele etapei: 

1. Evaluarea efectelor produsului bacterian asupra microbiotei intestinale a puilor de găină și purceilor și a calității senzoriale a cărnii

1. Obținerea produsului microbian microîncapsulat.
2. Încorporarea în nutrețul combinat.
3. Testarea pe purcei sugari și în criza de înțărcare.
4. Validarea produsului complex.

 Activitatea 3.1.2. Evaluarea calităţii senzoriale  a cărnii

 # S-a efectuat de către USAMV Cluj un studiu privind caracteristicile microflorei la pui și purcei. S-a testat la nivel de laborator efectul inhibitor al unei tulpini probiotice (Lactobacillus plantarum ATCC 8014) asupra unei tulpini cu potențial patogen (Escherichia coli ATCC 25922). Pentru aceasta s-a co-incubat tulpina probiotică de L. plantarum cu tulpina enterotoxigenă E. coli timp de 24, 48 și 72h la temperatura de 37^oC. S-au realizat grupe de concentrații diferite de co-culturi urmărindu-se în acest fel viabilitatea celor două tulpini luate în studiu.

Rezultatele obținute:

• Pentru grupa I în care s-au co-incubat 10⁹ UFC/mL plantarum cu 10⁷ E. coli, a rezultat un număr de 130x10⁷ UFC/mL pentru E. coli, după 24h. În cadrul aceleiași grupe, după incubarea timp de 48h a rezultat un număr de 200x10⁷ UFC/mL, iar după 72h a rezultat un număr de 350x10⁷ UFC/mL pentru E. coli.
• Pentru grupa II în care s-au co-incubat 10⁹ UFC/mL plantarum cu 10⁵ E. coli, a rezultat un număr de 28x10⁵ UFC/mL pentru E. coli, după 24h. În cadrul aceleiași grupe, după incubarea timp de 48h a rezultat un număr de 30x10⁵ UFC/mL, iar după 72h a rezultat un număr de 25x10⁵ UFC/mL pentru E. coli.
• În ceea ce privește grupa III, după 24h de co-incubare a celor două tulpini s-au obținut 20x10⁵ UFC/mL, 25x10⁵ UFC/mL după 48h, și 20x10⁵ UFC/mL după 72h.
• În cazul grupei IV s-au obținut 1x10⁴ UFC/mL după 24h, 2x10⁴ UFC/mL după 48h, și 0 UFC/mL după 72h.
• În urma rezultatelor obținute în cazul celor patru grupe formate se poate evidenția faptul că tulpina plantarum ATCC 8014 având o concentrație de10⁹ UFC/mL are capacitatea de reduce în mod semnificativ dezvoltarea tulpinii de E. coli ATCC 25922 la concentrații inferioare (10⁷, 10⁵, 10⁴), și după un timp de incubare mai îndelungat (48h, 72h).

# S-au testat in vitro, la INCDBNA Balotești, unele proprietăți probiotice la tulpini de Lactobacillus sp. în vederea microîncapsulării și s-au stabilit caracteristici fenotipice și genotipice (analiză BLAST). Un număr de 14 tulpini bacteriene de Lactobacillus sp. au fost izolate și identificate din conținut intestinal de la purcei. S-au aplicat teste preliminare cu privire la viabilitatea acestora, rezistență pH (2 și 3), săruri biliare (ox gall 0,3%), antibiotice și toleranța la temperatură ridicată.

Rezultatele obținute:

• S-au caracterizat fenotipic 14 tulpini din care s-au selectat 2 pentru microîncapsulare, confirmate molecular (Analiza BLAST): Lactobacillus acidophilus, IBNA 76 și Lactobacillus plantarum 1, IBNA 84.
• Lactobacillus acidophilus , IBNA 76:

Cultural :   colonii mici, opace, albicioase; turbiditate foarte redusă, neomogenă, cu flocoane în suspensie, depozit abundent, floconos.

Morfologic: bacil Gram pozitiv lung sau mediu, gros sau  mediu, cu 1-2 granule metacromatice per celulă, grupat în filamente

Biochimic:

• API 50 CHL: acidophilus 3, -90,1;
• ABIS online: 3. Taiwanensis - 82,7; 4. L. lindneri, -82,7; Targeted taxon L. acidophilus -75,8 CFU/mL: 2 x 10⁹

1. Lactobacillus plantarum 1, IBNA 84.

Cultural :  colonii mari, opace, albicioase, tip S;  turbiditate medie/intensă, omogenă, depozit abundent, pulverulent

Morfologic: bacil Gram pozitiv scurt, subțire, rar cocobacil, dispus în grămezi neregulate.

Biochimic:

• API 50 CHL: plantarum 1, -85,4;
• ABIS online: 1. nantensis, -92,1; 2. L. plantarum, -90,5 CFU/mL: 9,7 x 10¹⁰

# Pentru obținere de produs probiotic microîncapsulat sub formă de pulbere, dintr-un total de 14 tulpini de Lactobacillus sp. izolate, confirmate și evaluate din punct de vedere al gradului de supraviețuire de-a lungul tractului gastrointestinal animal, s-au selectat și supus procesului de microîncapsulare 2 tulpini acidolactice (Lactobacillus acidophilus IBNA 76 și Lactobacillus plantarum IBNA 84), tulpini ce au înregistrat o acumulare ridicată de biomasă în urma procesului fermentativ (Bioreactor EPPENDORF cu capacitate de 5L) cu respectarea condițiilor optime de creștere ( 37°C, 24 ± 2 h, 220 rpm, pH 6.4).

# S-a efectuat stagiu pentru procesul de microîncapsulare la partenerul USAMV Cluj.

Rezultatele obținute:

• S-au obținut și optimizat 2 produse bacteriene pe bază de Lactobacillus sp. (Lactobacillus acidophilus IBNA 76, LA și Lactobacillus plantarum IBNA 84, LP).
• Adaosul de LA în doză de 1 x 10⁸ UFC/gram în NC la purceii sugari a îmbunătățit numărul de Lactobacillus sp. în lotul LA comparativ cu lotul Martor, astfel:
• la nivel de ileon cu 6.68%,
• la nivel de cecum cu 4.89%.
• Suplimentarea hranei la purceii sugari cu produs probiotic pe bază de Lactobacillus acidophilus IBNA 76, a contribuit semnificativ la scăderea numărului de coliformi, clostridii și enterococi, cu o inhibare pozitivă asupra coloniilor de E. coli β-hemolitic, comparativ cu lotul Martor unde gradul de multiplicare al bacteriilor patogene fost foarte ridicat.

# S-a efectuat la INCDBNA Balotești un test biologic pentru evaluarea efectelor produselor microîncapsulate  pe purcei sugari și în criza de înțărcare.

Purceii au fost repartizați în 4 loturi experimentale și furajați diferențiat: 1) rețeta de control (M), în care au fost asociate optim ingrediente furajere netradiționale: șrot muștar, șrot cânepă, ulei de cânepă, cu ingrediente convenționale; 2) experimental LA, rețeta de control la care s-a adăugat produs bacterian microîncapsulat pe bază de Lactobacillus acidophilus-1%; 3) experimental LP, rețeta de control la care s-a adăugat produs bacterian microîncapsulat pe bază de Lactobacillus plantarum-0,1%; 4) experimental LA:LP, rețeta de control la care s-a adăugat produs bacterian microîncapsulat pe bază de amestec Lactobacillus acidophilus: Lactobacillus plantarum-1,1%.

Rezultatele obținute:

• Administrarea nutrețului combinat aditivat la loturile experimentale a condus la un spor mediu zilnic și un consum mediu zilnic similar lotului M. Consumul specific (kg nc/kg spor), corelat cu consumul mediu zilnic şi sporul în greutate a înregistrat valori comparabile între loturi.
• Prin utilizarea de produs bacterian micro-încapsulat la lotul LA și lotul LP se reduce scorul fecal gradul 2 și 3, respectiv cazurile cu diaree medie și agresivă, precum și incidența diareei cu 50% față de nutrețul combinat clasic. Amestecul bacterian micro-încapsulat LA:LP a condus la un scor fecal gradul 2 și 3 similar lotului M. Incidență diareei la lotul LA:LP a fost mai mică cu 37,5% comparativ cu lotul M (diferențe nesemnificative; P>0.05).
• La înțărcare s-a observat o reducere a greutății stomacului de 2,86 ori până la 3,96 ori și, respectiv a intestinului subțire de 1,54 ori până la 1,80 ori, ca efect al adaosului de produs bacterian micro-încapsulat cu amestec LA:LP.
• La 7 zile după înțărcare, administrarea nutrețului combinat aditivat la loturile experimentale a condus la greutăți ale tractului gastrointestinal similare lotului M.
• La înțărcare, prin utilizarea de produs bacterian micro-încapsulat LA se constată o scădere semnificativă a pH-ului în stomac cu 10,84%, în jejun cu 6,66%, în cecum cu 3,33%, în intestin gros cu 1,63% comparativ cu lotul M. Produsul bacterian micro-încapsulat cu amestec LA:LP contribuie la o creștere semnificativă a pH-ului în stomac cu 25,00%, în jejun cu 15,49%, în cecum cu 7,69%, în intestin gros cu 4,41% raportat la M. Furajul cu LP conduce la valori ale pH-ului în segmentele tubului digestiv, similare lotului de M.
• La 7 zile după înțărcare, administrarea nutrețului combinat aditivat cu LA și LP, a condus la scăderea semnificativă a pH-ului în stomac și jejun (16,28%, respectiv 10,71%) și (51,51%, respectiv 12,72%) comparativ cu lotul M.

Activitatea 3.2.2. Prelevare probe / Set analize  moleculare pentru caracterizarea microbiotei intestinale

# La finalul experimentului s-au sacrificat un număr de 20 animale, în vederea recoltării de probe conținut tract digestiv, în urma cărora s-a stabilit microflora la nivel de ileon si cecum și evoluția pH-ului de-a lungul tractului gastrointestinal (stomac, ileon, cecum, intestin gros) ca efect al adaosului de preparat probiotic bacterian microîncapsulat.

Rezultatele obținute:

• Tulpinile bacteriene selectate, respectiv Lactobacillus acidophilus IBNA 76 și Lactobacillus plantarum IBNA 84, cu caracter probiotic ridicat (procent supraviețuire ridicat la pH și săruri biliare), au capacitatea de a menține echilibrul microflorei intestinale la purcei (30 ± 3 zile, respectiv 37 ± 3 zile) și de a intra în competiție cu tulpinile patogene inhibându-le dezvoltarea și multiplicarea.
• Bacteriile acidolactice administrate ca surse probiotice și incluse în rațiile furajere la purceii crescuți în fermele cu sistem intensiv de creștere, pot stimula microflora intestinală, manifestând efecte pozitive în ceea ce privește apariția unor posibile incidențe diareice, care ar conduce la dezechilibre gastrointestinale și o creștere a frecvenței enteritelor.

Activitatea 3.3.2. Diseminarea rezultatelor cercetărilor

• S-au încheiat 2 contracte de transfer tehnologic.
• S-au publicat 2 articole ISI și 2 sunt în recenzie.
• S-a publicat 1 articole BDI, unul este acceptat.
• S-au depus 2 cereri de brevet la OSIM.
• S-au publicat 2 broșuri.

Indicatori de rezultat care au contribuit la diseminarea rezultatelor proiectului : 

• Contract de transfer tehnologic nr. 2769/21.04.2020/21.04.2020 - SC AGROPIG Farm SRL
• Contract de transfer tehnologic nr. 2767/21.04.2020/021.04.2020 - SC Nellmar Transilvania SRL

Lucrări științifice/ comunicări/ cereri de brevet: 

Lucrari ISI:

1. Dumitru M., Habeanu M., Lefter N.A., Gheorghe A., 2020 The effect of Bacillus licheniformis as direct-fed microbial product on growth performance, gastrointestinal disorders and microflora population in weaning piglets. Rom Biotechnol Lett.; 25(6): 2060-2069. DOI: 10.25083/rbl/25.6/2060.2069
2. Anca Gheorghe, Nicoleta A. Lefter, Lavinia Idriceanu, Mariana Ropotă and Mihaela Hăbeanu Effects of dietary extruded linseed and Lactobacillus acidophilus on growth performance, carcass traits, plasma lipoprotein response, and cecal bacterial populations in broiler chicks2020. Italian Journal of Animal Science 19(1): 822-832
3. Mihaela Hăbeanu, Anca Gheorghe, Mihaela Dumitru, Nicoleta Aurelia Lefter, Lavinia Idriceanu, Smaranda Mariana Toma, Crina Daniela Neacșu, Gina Cecilia Pistol Assessment of associated effects of the milk and feed composition on suckling piglets growth parameters, immune response and digestive disorders. Animals În recenzie
4. Dumitru M., Hăbeanu M., Sorescu I, Effects of Bacillus spp. use as a dietary probiotic in weaning piglets. SASAS Journal În recenzie.

Lucrari BDI

1. Idriceanu Lavinia, Silvia Mironeasa, Anca Gheorghe, Nicoleta Aurelia Lefter, Madalina Iuga, Daniela Mihaela Grigore, Mihaela Habeanu. Effects of the extruded linseed and walnut meal on some quality characteristics of longissimus dorsi and semitendinosus muscle of pigs Scientific Papers. Series D. Animal Science. Vol. LXIII, No. 1, p 128- 134, 2020
2. Dumitru M., Hăbeanu M., Lefter N Effects of direct-feed microbial Bacillus supplementation on piglet’s microbiota. Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies, Acceptat. vol 2 (xx).2020.

 Cereri brevet

1. Mihaela Habeanu, Gheorghe Anca, Cristina Tabuc Tehnologie nutritionala bazata pe un macro-mix cu proprietati functionale pentru purcei. OSIM A 2309/02.04.2020
2. Dumitru Mihaela, Vodnar Dan, Habeanu Mihaela, Chelaru Nicoleta Raluca, Simon Elemér, Sorescu Ionut, Ciurescu Georgeta, Tabuc Cristina, Gheorghe Anca. Procedeu de izolare, caracterizare si obtinere a unor produse bacteriene de Lactobacillus salivarius. OSIM A/00039/30.01.2020

Comunicări

1. Lefter N. A., Dumitru M., Gheorghe A., Idriceanu L., Hăbeanu M The influence of Bacillus licheniformis as feed additive on performances and gastrointestinal disorders of weaning piglets. 7th Annual Conference “Strengthening Food Security and Environmental Sustainability ORAL/ April 28, 2020, Bucharest Romania.
2. Lefter N. A., Dumitru M., Gheorghe A., Idriceanu L., and Hăbeanu M Soluție nutrițională pe bază de sorg, mazăre și Bacillus licheniformis ca aditiv furajer pentru purcei în criza de înțărcare”Abordări sistemice și posibile soluții inovatoare de reducere a emisiilor de gaze cu efect de seră din sectorul zootehnic, în contextul noului pact verde european – «de la fermă în furculiță”, ORAL / INCE/CE-MONT, sept 2020 online
3. Dumitru M., Lefter N., Habeanu M., Cercetări in vitro asupra tulpinii de Bacillus licheniformis în vederea utilizării în hrana purceilor în criza de înțărcare ca sursă de aditiv furajer. Abordări sistemice și posibile soluții inovatoare de reducere a emisiilor de gaze cu efect de seră din sectorul zootehnic, în contextul noului pact verde european – «de la fermă în furculiță”, ORAL / INCE/CE-MONT, sept 2020 online
4. Dumitru M., Lefter N., Habeanu M., Gheorghe A., Idriceanu L New Research on Bacillus licheniformis Bio Feed Additive Effects on Piglet’s Microbiota during Weaning crisis. 7th Annual Conference Strengthening Food Security and Environmental Sustainability. ONLINE 2020/ 27-29 aprilie.
5. Dumitru M., Hăbeanu M., Lefter N. Effects of direct-feed microbial Bacillus supplementation on piglet’s microbiota. Conference Agriculture for life, life for Agriculture. 2020/, 4-6 iunie (online)
6. Lefter N. A., Hăbeanu M., Gheorghe A., Idriceanu L. Growth response and health status of growing pigs fed millet grain as a partial replacement for triticale 22th International Conference on Animal Diseases, Nutrition and Breeding E-Poster / Prague, Czechia, March 19 - 20, 2020. 

Lucrări de popularizare și asimilate

1. Lefter N.A., Dumitru M., Gheorghe A., Idriceanu L. și Hăbeanu M. Soluții nutriționale pe bază de sorg, mazăre și aditiv furajer microbian pentru purcei Brosura ISBN 978-606-11-7409-6
2. Dumitru M., Lefter N., Habeanu M., Gheorghe A. Obtinerea unui aditiv furajer pe baza de Bacillus licheniformis și efectul acestuia asupra microbiotei purceilor în criza de înțărcare. Brosură ISBN 978-606-11-7410-2

Utilizare CEC-uri

Au fost utilizate doua cecuri de mobilitate tip B - Mobilități pentru - vizite de lucru ale cercetătorilor cu experiență la partenerul USAMV Cluj.

 

ETAPA 4/2021

Efectele produsului bacterian asupra microbiotei bacteriene intestinale a puilor de găină a calităților senzoriale (pH, reacţia Kreiss, determinarea hidrogenului sulfurat).

Obiectivul etapei: Diseminarea pasivă și activă a rezultatelor cercetării

ACTIVITĂȚI:

Activitatea 4-2-1. Diseminarea rezultatelor cercetărilor .

3 articole ISI -acceptate:

1. Dumitru M., Hăbeanu M., Sorescu I., 2021. Effects of Bacillus spp. use as a dietary probiotic in weaning piglets. The South African Journal of Animal Science (SAJAS). (IF 0.847). Acceptat.
2. Dumitru M., Sorescu I., Ciurescu G., Habeanu M., 2021. Isolation, identification, preservation and determinations of lactic acid bacteria from chicken’s gut content at 26 days old. Rom Biotech Lett.: 26(4), 2765-2772. DOI: 10.25083/rbl/26.4/2765-2772 (IF 0.765).
3. Dumitru M., Habeanu M., 2021. Production and evaluation of extracellular enzymes from Bacillus Licheniformis in different raw materials used in animal feed. Scientific Papers. Series D. Animal Science (acceptat). (IF 0). Acceptat

1 articol  BDI publicat / 1 articol acceptat:

1. Dumitru M., Lefter N., Idriceanu L., Ciurescu G., Habeanu M., 2021. Identification and characterization of Bacillus megaterium as probiotic bacteria in chicken broiler feed. Scientific Papers: Animal Science and Biotechnologies: 54(1) 124-133.
2. Gheorghe A., Hăbeanu M., Dumitru M., Lefter N.A., Idriceanu L. Performance and intestinal microflora response of broilers to a probiotic mixture supplementation. Archiva Zootechnica (acceptat)

Communicări:

1. Dumitru M., Sorescu I., Vodnar I., Elemer S., Ciurescu G., Habeanu M., 2021. Probiotics potential and microencapsulation of lactic acid bacteria as potential source for poultry. 72nd Annual Meeting of European Federation of animal Science EAAP, Davos (Switzerland) (abstract 35659, Session 99: Free communications) 30 – 03 September.
2. Dumitru M., Habeanu M., 2021. Production and evaluation of extracellular enzymes from Bacillus Licheniformis in different raw materials used in animal feed. Conference Agriculture for life, life for Agriculture”, 3-5 juin.

A fost încheiat 1 acord de colaborare nr. 1976/31.03.2021.

1 metodă diseminată de Partenerul UB: Metodă de diagnostic molecular a diferiților taxoni bacterieni

 

 

 

 

Nutritia pasarilor- o cale naturala de mentinere a sanatatii tractusului digestiv, performantelor si calitatii alimentelor in conditiile interzicerii antibioticelor

Context : In prezent, cererea pentru alimentele de origine animala (atât cantitatea cat si cerințele societale pentru calitate) constituie o provocare pentru sectorul zootehnic cu accent deosebit pe nutriție. Latura calitativă implică mai ales efectele asupra sănătății consumatorului, bunăstarea animalelor si protejarea mediului înconjurător. Este nevoie de asemenea de alimente sigure provenite de la animale sănătoase. Asigurarea sănătății animalelor de fermă este o altă provocare la care sectorul zootehnic trebuie sa facă față mai ales după interzicerea de la 1 ianuarie 2006 a utilizării in furaje antibioticelor ca factori de creștere ca o consecință a creșterii rezistenței la antibiotice a anumitor tulpini de bacterii, incluzându-le pe cele mai patogene precum Salmonella spp., Campylobacter spp., Escherichia

Obiectivul proiectului consta in obținerea și validarea unor noi rețete furajere pentru păsări care conțin fitoaditivi mai puțin cunoscuți/investigați, produși de IMM-uri locale capabili să mențină sănătatea tractusului digestiv, a performanțelor și calității alimentelor si care sa înlăture nevoia utilizării de antibiotice. Parteneriatul format, va asigura obținerea de răspunsuri aprofundate, dincolo de înregistrarea performantelor productive.

 

1)Elaborarea si testarea experimentala a unor noi retete furajere pentru gaini ouatoare in vederea mentinerii sanatatii tractusului digestiv, performantelor si calitatii oualor.

 

Activitate 3-1-1: Identificarea si caracterizarea unor fitoaditivi de provenienta locala care pot fi folositi ca alternative la folosirea antibioticelor in hrana gainilor ouatoare; parteneri implicati (CO-IBNA). Au fost idenificate 9 plante cu rol de fitoaditivi vegetali (frunze de afin, frunze de nuc, fenicul pulbere si seminte, menta, galbenele, coaja de pepene, srot de catina, seminte de susan) si un amestec vegetal format din: frunze de nuc+frunze de afin+srot de catina). Plantele au fost caracterizate fizico-chimic (compozitie primara, minerale, polifenoli, capacitate antioxidanta, vitamine, aminoacizi, acizi grasi) pentru stabilirea continutului de nutrienti si compusi bioactivi in vederea utilizarii ca posibile alternative la folosirea antiobioticelor in hrana pasarilor.

Activitate 3-1-2 si 3-1-3: Listarea parametrilor definitorii care urmeaza sa fie determinati, in experimentele in vivo, pentru evaluarea performantelor productive, sanatatii tractusului digestiv si calitatea nutritionala a oualor. Elaborarea unor noi retete furajere pentru gaini ouatoarea care sa asigure performantele producative, mentinerea sanatatii tractusului digestiv si a calitatii nutritionale a oualor de consum. Elaborare protocol experimental; parteneri implicati (CO-IBNA; P1-UB-DBBM; P4-USV). Dupa caracterizare, au fost  selectate 4 plante (frunzele de afin, frunzele de nuc, srotul de catina si coaja de pepene rosu) si un amestec (25% frunze afin, 25% frunze nuc, 50% srot catina) pentru  testarea „in vivo”  pe gaini ouatoare. Au fost elaborate si fabricate 5 noi retete nutritionale, conforme cu cerintele nutritionale ale hibridului Tetra SL,  isoproteice si isoenergetice (2800 kcal/kg energie metabolizabila și 17.8% proteina): E1 (frunze de afin); E2 (frunze de nuc); E3 (srot de catina); E4 (amestec din frunze de afin, catina si frunze de nuc) si E5 (coaja de pepene). Totodata, s-a realizat listarea parametrilor definitorii fizici si biochimici care s-au determinat prin masuratori fizice si/sau  biochimice din probele recoltate pe parcursul experimentului desfasurat pe gaini ouatoare furajate cu noile retete, in vederea evaluarii impactului acestora asupra performantelor, sanatatii gainilor si a calitatii nutritionale a oualor.

Activitate 3-1-4, 3-1-5 si 3-1-6: Testarea de noi retete furajere prin experimente desfasurate „in vivo”  pe  gaini ouatoarea care sa asigure performantele productive, stabilirea valorii nutritionale a oualor si evaluarea sanatatii tractusului digestiv; (parteneri implicati: CO-IBNA; UB-DBBM; USV). Evaluarea eficacitatii retetelor cu fitoaditivi s-a realizat printr-un experiment desfasurat timp de 4 saptamanai pe 168 gaini Tetra SL (32 saptamani; 6 loturi). Cuantificarea efectelor folosirii noilor rețete furajere asupra performantelor productive, valorii nutritionale a oualor si evaluarea sanatatii tractusului digestiv si a starii de sănătate a păsărilor, s-au efectuat prin: ⁽¹⁾monitorizarea parametrilor de productie (consum zilnic sau specific de furaj, greutate ou, intensitate la ouat); ⁽²⁾calitatea fizica, reologica si nutritionala a oualor (parametrii fizici interni si externi, test de compresiune ou, analiza senzorială, parametrii reologici albus, compozitie chimica galbenus: continutul de acizi grasi, luteina+zeaxantina, capacitatea antioxidanta, polifenoli totali si stabilitatea oxidative a gălbenușului de ou); ⁽³⁾analize de sange si sacrificari in vederea  recoltarii de probe de intestin si continut intestinal pentru evaluarea sanatatii tractusului digestiv prin determinari fizice (masuratori, pH), microbiologice, histologice si enzimatice.

 

2) Elaborarea si testarea experimentala a unor noi retete furajere pentru puii de carne in vederea mentinerii sanatatii tractusului digestiv, performantelor si calitatii carnii.

 

Activitate 3-2-1: Identificarea si caracterizarea unor fitoaditivi de provenienta locala care pot fi folositi ca alternative la folosirea antibioticelor in hrana puilor de carne; parteneri implicati (CO-IBNA; P1-UB-DBBM). Fitoaditivii  identificati ca alternativa la folosirea antibioticelor in hrana puilor de carne au fost: șrotul de in (sursa PUFA); uleiul din sâmburii de struguri si tescovina din struguri si cojile de citrice (portocala dulce si grapefruit rosu). Rezultatele obtinute pentru analiza chimica au aratat ca fitoaditivii indeplinesc cerintele nutritionale pentru utilizarea ca materii prime furajere in hrana puilor de carne fiind surse bogată de compuși bioactivi- zaharuri, acizi organici, flavonoide și vitamine cu proprietăți antioxidante, anticancerigene, antimicrobiene şi antiinflamatorii.

Activitatea 3-2-2: Elaborarea unor noi retete furajere pentru puii de carne; elaborare protocol experimental; Parteneri implicati (CO-IBNA). Pentru fiecare experiment au fost elaborate seturi de retete furajere in funvctie de faza de crestere: Au fost elaborate 4 seturi de retete furajere pentru cele doua faze de crestere a puilor: experiment 1- Set de retete (4) pe baza de tescovina (din struguri albi sau rosii); Experiment 2- Set de retete (2) care au inclus uleiul din samburi de struguri; Experiment 3 - Set de retete (2) care au inclus coji de citrice (portocale si grapefruit rosu) ; Experiment 4 - Set de retete (2) care au inclus un antioxidant natural din struguri rosii. Inainte de fabricarea retetelor, a fost elaborat un protocol experimental in care au fost precizate caracteristicile specifice fiecarui experiment.

Activitatea 3-2-3: Testarea noilor retete furajere prin experimente desfasurate „in vivo” pe loturi de pui de carne; (parteneri implicati CO-IBNA). Experimentele s-au desfasurat pe pui Cobb 500 (40 (pui/lot, perioada crestere-finisare, 4 săptămâni). Parametrii urmăriți in timpul derularii experimentelor: ⁽¹⁾parametrii de producție (greutate vie, spor mediu zilnic, consum mediu zilnic, consumul specific); ⁽²⁾parametrii de microclimat (temperatura și  umiditatea; dioxid de carbon, ventilație); ⁽³⁾analiza chimică a  materiilor prime furajere și nutrețuri combinate; ⁽⁴⁾calitatea nutritională a carnii de pui; ⁽⁵⁾dezvoltarea carcasei și a organelor puilor (vârsta 42 zile); ⁽⁶⁾starea de sănătate a păsărilor și sănătatea tractului digestiv;

 Activitatea 3-2-4: Sacrificari in vederea  recoltarii de probe de intestin si continut intestinal pentru evaluarea sanatatii tractusului digestiv prin determinari fizice (masuratori, pH), microbiologice, histologice, enzimatice; (parteneri implicati CO-IBNA; P1-UB-DBBM). Rezultatele înregistrate în decursul experimentelor au evidențiat aspecte privind scaderea semnfiicativa a bacteriilor patogene analizate si cresterea bacteriilor benefice pentru mentinerea unei microflore normale. Compușii fenolici pot stimula selectiv creșterea bacteriilor benefice, cum ar fi Lactobacillus și Bifidobacterium, modificand microbiota intestinală.

 Activitatea 3-2-5: Determinarea valorii nutritionale si a proprietatilor organoleptice din probe de piept si pulpa de pui recoltate la sacrificare;parteneri implicati (CO-IBNA; USV). Rezultatele obtinute pentru calitatea nutritionala a carnii exprimate prin continutul de acizi grasi (PUFA) au evidentiat variatii semnificative ale continutului acestora precum si variația culorii cărnii de pui. Analiza profilului de textură (TPA) a determinat cresterea parametrilor: duritatea, elasticitatea și reziliența pulpei de pui (Experimentele 1, 3 si 4), fara a influenta textura carnii provenite din experimentul 2. De asemenea, statusul oxidativ al probelor de carne au o încetinire a procesului de degradare lipidică;

 

3)Evaluarea si valorificarea rezultatelor obtinute in urma testarii noilor retete furajere pentru gaini ouatoare si pui de carne.

 

Activitatea 3-3-1: Evaluarea rezultatelor tehnice, statistice si economice a datelor obtinute pe durata  proiectului; parteneri implicati (CO-IBNA). O evalaure a tuturor rezultatelor obtinute pe toata perioada proiectului a fost realizata in vederea valorificarii acestora.

Activitatea 3-3-2 si 3-3-3: Elaborarea documentatiei de depunere a doua cereri de brevet pentru o noua structura de nutret combinat folosit la gaini ouatoare si pui de carne ; parteneri implicati (CO-IBNA). In cadrul activitatii au fost elaborate doua cereri de brevet.

 

4)Valorificarea rezultatelor proiectului

 

Activitatea 3-4-1: Diseminare prin publicarea de articole stiintifice in reviste ISI sau BDI; parteneri implicati (IBNA-LCF; UB-DBBM; US). In cadrul activitatii au fost elaborate 3 articole ISI, dintre care 2 publicate si 1 in recenzie; 2 articole BDI publicate si 3 acceptate pentru publicare. Articolele au cuprins date stiintifice obtinute pe parcursul derularii proiectului.

Toate articolele (ISI si BDI), conferintele, produsele si transferul tehnologic obtinue in Proiectul component nr. 3 se regasesc in Raportul tehnic final (2018-2021)

Activitatea 3-4-2: Elaborarea unui ghid privind noi strategii nutritionale pentru pasari privind  mentinerea sanatatii tractusului digestiv, performantelor si calitatii alimentelor  in conditiile interzicerii antibioticelor; parteneri implicati (IBNA-LCF; UB-DBBM; US). Au fost elaborate 2 ghiduri privind noi strategii nutritionale pentru pasari cu scopul  mentinerii sanatatii tractusului digestiv, performantelor si calitatii alimentelor  in conditiile interzicerii antibioticelor.

 

 

 

Dezvoltarea de produse furajere pe bază de extrase din plante, pentru îmbunătățirea performantelor productive prin manipularea mediului ruminal

Obiectivul proiectului consta in estimarea efectelor unor extrase de plante asupra mediului ruminal, în vederea identificării unor avantaje (îmbunătățirea metabolismului ruminal proteic/energetic) care să justifice includerea acestora în rațiile/produsele furajere destinate rumegătoarelor.

Activitati prevazute. Pentru evaluarea efectelor extraselor din plante vor fi utilizate metodele clasice (aplicate de IBNA, dar si prin noi metode, de tip “-omics” (metabolomică = analiza biomarkerilor/metaboliților – UBB, genomică = cuantificarea cu precizie a ecosistemului ruminal – UB-DBBM, proteomică = estimarea efectelor asupra fracțiunilor proteice relevante din lapte – IBAR), valorificând aparatura si expertiza avansată a partenerilor in domeniile respective. Aceasta colaborare va permite nu numai un potențial mult mai ridicat de a genera cunoaștere științifică și rezultate aplicative, cu impact ridicat în practica zootehnică, dar va permite și relansarea IBNA pe direcții de cercetare aflate la confluența între nutriția animală și tehnologiile “-omics”, noi colaborări / proiecte (inclusiv internaționale) pe aceste direcții, etc.

Etapa 1. Identificarea și caracterizarea nutrițională a nutrețurilor de studiat; asigurarea condițiilor experimentale necesare, optimizare de metode

Aceasta etapa a cuprins patru activitati, derulate în colaborare de catre cei patru parteneri ai proiectului (Universitatea Bucuresti, Universitatea Babes-Bolyai, Institutul de Biochimie / Academia Romana):

Activ. 1.1 – Stabilirea designului experimental, asigurarea condițiilor experimentale necesare, selecționarea nutrețurilor de studiat în acord cu scopul propus

Pe langă asigurarea cadrului de derulare a testelor / experimentelor prevăzute în cadrul proiectului (asigurarea animalelor, pieselor de schimb, metodelor și procedurilor analitice, reactivilor, etc.) această activitate a condus la elaborarea unui studiu bibliografic si a unei baze de date, pe baza carora a fost relizată lista prelimnară a nutreturilor / extraselor de plante / aditivilor furajeri de studiat în cadrul proiectului. Pentru aceasta, au fost trecute în revistă și nutrețurile care prezintă un potențial de valorificare în furajarea rumegătoarelor, prin prisma specificului proiectului. Un rol important în această l-a constituit caracterizarea nutrițională a acestor nutrețuri. Pe lângă parametrii clasici care definesc un nutreț (valoarea proteică, valoarea energetică, etc.) valoarea nutrițională este dată și de prezența unor substanțe active (metaboliți secundari ai plantelor) care pot influența metabolismului ruminal / performanțele zootehnice ale animalelor – nivelul producției de lapte, profilul proteinelor din lapte, etc. (în sens pozitiv / negativ). Daca parametrii clasici sunt relativ bine cunoscuți, efectele substanțelor active sunt insuficient sau chiar deloc studiate (pentru anumite plante / clase de substanțe). Prin urmare, trecerea în revistă / caracterizarea nutrițională s-a concentrat asupra potențialelor efecte pozitive ale acestor nutrețuri / substanțe (reducerea degradabilității ruminale, creșterea digestibilității pereților celulari, modificarea raportului C2/C3, tamponarea efectului acidogen al rațiilor, etc.).
Nutrețurile / extrasele de plante / aditivii furajeri din această listă vor intra in studiu în următoarea etapă; acestea vor fi selecționate în continuare, pe baza rezultatelor analizelor chimice -> testelor in vitro -> experimentelor de metabolism ruminal; astfel încât prin eliminări succesive să rămână 2- 6 variante experimentale de studiat, prin prisma efectelor asupra performantelor productive ale vacilor de lapte. Pe de altă parte, lista rămâne deschisă daca analiza relevă o oportunitate deosebită pentru resurse furajere încă neluate în calcul (ex. daca un anumit nutreț / aditivi furajer devine disponibil pe piața nutrețurilor / aditivilor din România; dacă există solicitări exprese din partea asociațiilor profesionale angrenate în colaborări cu institutul coordonator, etc.)

Activ. 1.2 – Identificarea markerilor moleculari utili în identificarea taxonilor bacterieni și în caracterizarea cantitativă a microbiotei ruminale

În cadrul acestei activități au fost stabiliti markerii și desemnati primerii ce vor fi utilizați pentru caracterizarea microbiotei ruminale. Pentru aceasta a fost izolat ADN din lichidul ruminal (cu diverse metode) și a fost determinată (prin spectrofometrie) puritatea și concentrația probelor ADN extrase din lichid ruminal, a fost verificată integritatea probelor de ADN extrase, a fost testată amplificarea probelor de ADN extrase prin această metodă (prin PCR în gradient de temperatură), etc.
În cursul experimentelor au fost îmbunătățite/adaptate unele protocoale de lucru (ex. prin optimizarea timpului de incubare, optimizarea reacţiilor de amplificare, optimizarea temperaturii specifice de hibridizare pentru primerii desemnați, etc.)
Derularea activității a condus la stabilirea protocolului de lucru (metoda de extractie, markerii, primerii) cel mai potrivit pentru scopul proiectului.

Activ. 1.3 – Analiza fezabilității utilizării unor metaboliți ca biomarkeri specifici nutriției animalelor de fermă

Biomarkerii reprezintă molecule biologice regăsite în sânge, în alte lichide biologice sau în țesuturi, ce oferă informații despre procesele biologice din organism, fiziologice sau anormale. Un biomarker poate fi utilizat pentru a înregistra răspunsul organismelor asupra unor tratamente sau a unor modificări de orice natură, a eficienței utilizării substanțelor nutritive consumate, etc.
În acest context, analiza de fezabilitate s-a concentrat pe luarea în calcul a potențialului de monitorizare a parametrilor metabolici din plasmă, din lichidul ruminal (de mare importanță în productivitatea rumegătoarelor), dar și din lapte (produsul final urmărit). Ca urmare a analizei, a fost realizată o listă scurtă a biomarkerilor potențiali, din care vor fi selectați parametrii experimentali ce vor fi monitorizați în etapele următoare ale proiectuli (NEFA, BHB, derivați purinici din urină/lapte, etc.)

Activ. 1.4 – Stabilirea metodologiilor de abordat în vederea determinării fracțiunilor proteice din lapte

În această etapă de implementare a proiectului au fost testate două metode pentru analiza conținutului proteic al laptelui de vacă, folosind tehnica LC-MS/MS. Au fost identificate 163 de grupuri de proteine, un număr similar studiilor de proteomică efectuate pe probe de lapte. Nu s-au regăsit diferenmajorețe în privința identității proteomului între laptele proaspăt colectat și cel supus procesului de înghețare. Precipitarea proteinelor cu TCA a condus la identificarea unui număr mai mare de peptide și grupuri de proteine, în timp ce denaturarea cu agent chaotropic a condus la identificarea unui număr ușor crescut de situsuri fosforilate

 INDICATORI DE REZULTAT (cumulat)

Articole:

Comunicari:

• Comparative proteomics of fresh and frozen bovine milk. The Annual International Conference of the Romanian Society of Biochemistry and Molecular Biology, Bucharest, 5-7th September, 2018. Cristian V.A. Munteanu, Smaranda Toma, Cătălin Dragomir, Ștefana M. Petrescu

Altele:

• studiu bibliografic
• bază de date
• metode și proceduri analitice optimizate

Utilizare cecuri

In PC4 a fost utilizat un cec de tip B in scopul planificării activităților prevăzute în planul de realizare pentru anul 2018 si pentru discuții privitoare la activitățile privind biomarkerii de analizat in probele biologice (sânge/ lichid ruminal/ lapte) de către partenerul UBB Cluj Napoca. In proiect a fost utilizat si un cec de tip C pentru preluarea de metode de spectroscopie FT (transformata Fourier) și cromatografia in strat subțire de la partenerul UBB Cluj Napoca.

 

 Etapa 2 / 2019 – Realizarea experimentelor pe animale în condiții de laborator, finalizarea optimizării metodelor, analize preliminare

Această etapă s-a realizat urmărind cele șapte activități planificat și derulate în colaborare cu partenerii proiectului (Universitatea București, Universitatea Babeș-Bolyai, Institutul de Biochimie al Academiei Române)

Activ. 2.1 – Realizarea experimentului pe animale fistulizate, determinarea parametrilor ruminali, prelevarea de probe (lichid ruminal) pentru determinări suplimentare

Prin această activitate a fost identificat un plan experimental care să creeze premisele unor posibile efecte pe cele trei direcții de colaborare cu partenerii din proiect: biomarkeri asociați condiției de furajare, ecosistemul ruminal și proteomica laptelui. Au fost efectuate două experimente ce au la bază aceeași tipologie a alcătuirii rațiilor, și anume, înlocuirea sursei de energie. Practic, aportul de energie adus de amidonul din cereale a fost înlocuit cu aportul de energie adus de uleiul conținut de semințele de rapiță, menținând nivelurile de energie și proteină egale (izocalorice / izoenergetice) pentru ambele rații nutriționale (martor / experimental). Administrarea unor cantități însemnate de lipide în alimentația rumegătoarelor poate duce la apariția cetozei, modificare urmărită prin analiza unor biomarkeri serici specifici (β-hidroxibutirat - BHB). După 21 de zile de adaptare la rații, au fost prelevate probe de lichid ruminal în vederea studierii metabolismului ruminal (pH, concentrație de amoniac, concentrația de acizi grași volatili) și a microbiotei ruminale (identificare și cuantificare microscopică a protozoarelor din rumen + estimarea efectelor asupra populațiilor bacteriene și metanogene).

Activ. 2.2 – Derularea de teste preliminare pentru optimizarea metodelor de lucru (qPCR, Species Specific PCR) specifice evaluării cantitative și calitative a ecosistemului ruminal

Această activitate a cuprins izolarea ADN-ului din lichidul ruminal, determinarea purității și a concentrației extrase prin verificare spectrofotometrică și optimizarea metodei în funcție de rezultatele obținute. De asemenea, s-au realizat optimizări ale reacțiilor de amplificare Specie-Specific PCR și qPCR pentru determinarea populațiilor de microorganisme ruminale și evidențierea efectelor aduse de modificările nutriționale.

Activ. 2.3 – Identificarea taxonilor bacterieni la nivelul ecosistemului ruminal prin analiza genelor codificatoare pentru ARNr16S, CO I, cpn 60

Probele de ADN extrase au fost amplificate pentru markerii ADN selectați folosind perechi de primeri După verificarea electroforetică a produşilor de amplificare, aceştia au fost purificaţi utilizând kitul Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Secvențele obținute pentru probele analizate au fost comparate cu cele din GenBank, iar analiza BLAST a confirmat ca acestea aparțin genurilor și speciilor urmărite.

Activ. 2.4 – Adaptarea metodelor necesare determinării biomarkerilor specifici nutriției animalelor de fermă

În vederea realizării activităților 2.4, 2.5 si 2.6 a fost folosită perioada pre-experimentală aferentă experimentului pe vaci de lapte planificat pentru etapa următoare, fiind prelevate probe de lapte care au fost trimise la Universitatea Babes-Bolyai și la Institutul de Biochimie în vederea dezvoltării / optimizării metodelor ce urmează a fi utilizate.

Pentru analiza bazelor purinice (utilizate ca biomarkeri ai proteosintezei microbiene) s-a construit curba de calibrare cu ajutorul unui amestec standard de purine la diluţii diferite (10 concentraţii) cuprinse între 0.487-200 µg/mL utilizând un HPLC cu detector DAD. Pentru analiza biomarkerilor proteici din lapte a fost utilizat un HPLC-UV, în urma optimizării stabilindu-se caracteristicile metodei de lucru. Analiza concentrației BHB în lapte a fost realizată in microplacă transparenta, cu 96 de godeuri si cu folosind un kit bazat pe reacția enzimei β-HB Dehidrogenaza asupra BHB din proba (dezvoltat de producător pentru analiza BHB in serul sanguin).

Activ. 2.5 – Optimizarea parametrilor de extracție și prelucrare a proteinelor din lapte

Au fost analizate o serie de probe în vederea decelării unor posibile modificări la nivelul proteomului laptelui de vacă, prin schimbarea furajării animalelor și obținerea unui proteom comparativ, prin metoda optimizată în prima etapă de implementare a proiectului, între laptele degresat și cel complet. Pentru comparația proteomului laptelui degresat și a celui complet s-au luat în considerare șase probe din lotul martor (trei pentru fiecare condiție). Rezultatele au arătat identificarea unui număr mai mic atât de peptide triptice cât și grupuri de proteine în cazul extragerii proteinelor din laptele degresat. Astfel, au fost identificate 1074 peptide triptice, corespunzătoare a 150 de proteine în cazul laptelui degresat și 907 peptide, respectiv 127 proteine, în cazul alternativ.

Activ. 2.6 – Stabilirea parametrilor experimentali optimi specifici sistemului cromatografic și spectrometrului de masă pentru analiza proteomică a laptelui

Probele conținând peptidele extrase au fost supuse analizei LC-MS/MS, folosind parametri similari cu cei descriși în etapa precedentă de implementare a proiectului. Pentru analiza datelor LC-MS/MS a fost folosit algoritmul SEQUEST integrat în Proteome Discover v1.4 și proteomul Bos taurus. Experimentele LC-MS/MS a celor 24 de probe considerate în această etapă au condus la identificarea a mai mult de 1500 de peptide triptice, corespunzătoare a peste 200 de grupuri de proteine. Acest lucru este cu atât mai important cu cât, la analiza probelor, a fost utilizat un analizor de rezoluție înaltă, în cadrul căruia atât masele peptidelor identificate cât și a fragmentelor acestora prezintă o acuratețe de ordinul ppm (părți per milion), crescând confidența identificărilor. Proteomul obținut a fost caracterizat de un interval dinamic al abundenței relative a proteinelor de aproximativ cinci ordine de mărime, reflectând astfel variabilitatea mare a abundenței proteinelor din laptele de vacă. Distribuția numărului de proteine identificate la nivelul probelor analizate a arătat identificarea a peste 100 de proteine în majoritatea probelor analizate (mediana peste 100) și a peste 600 de peptide triptice per probă. Numărul a fost variabil între probe, lucru ce ar putea constitui o expresie a variabilității calitative a proteomului laptelui de vacă (între animale), considerând cantități aproximativ egale de probă. Analiza comparativă a probelor de lapte provenite de la animale furajate diferențiat a relevat faptul că din totalul de 239 de proteine identificate 177 au fost identificate în ambele condiții supuse analizei, în timp ce 18 și respectiv 44 au fost specifice lotului M și respectiv E. Cele 44 de proteine regăsite doar în probele de lapte prelevate din cadrul lotului cu furajare modificată ar putea indica o creștere a valorii proteice nutriționale a laptelui.

Aceste rezultate relevă faptul că metodele dezvoltate, precum și parametrii stabiliți pentru a fi utilizați în analiza proteomică a laptelui sunt adecvați obiectivului proiectului.

Activ 2.7 – Integrarea, interpretarea si diseminarea rezultatelor parțiale

În cadrul acestei etape au fost integrate rezultatele obținute de către coordonator si Universitatea București (ceilalți parteneri având planificate dezvoltări/optimizări de metode) și a fost continuată diseminarea prin prezentarea unui poster în cadrul unei conferințe internaționale. De asemenea, este în curs de elaborare un articol pe baza rezultatelor obținute în experimentul realizat pe animale fistulizate.

  

Diseminare

Conferințe Internaționale

Miuța Filip, Mihaela Vlassa , Irina Ciotlăuș , Ioana Boldea , Cătălin Dragomir. Preliminary results on the influence of particular feeding situations on the level of some potential biomarkers in cows' milk. The 33rd EFFoST International Conference: Sustainable Food Systems - Performing by Connecting , Wageningen University & Research , Rotterdam, The Netherlands, 12-14 November 2019.

  

Etapa 3 / 2020 – Realizarea experimentelor pe animale in condiții de fermă zootehnică, determinări biochimice

În cadrul acestei etape au fost derulate toate cele cinci activități planificate, în colaborare cu partenerii proiectului component: Universitatea București, Universitatea Babeș-Bolyai și Institutul de Biochimie al Academiei Române.

 

Activ. 3.1. Organizarea si derularea unui test pe vaci de lapte, prelevarea de probe pentru determinări suplimentare, de finețe

Experimentul s-a desfășurat în cadrul fermei IBNA, timp de 58 zile, pe 30 vaci de lapte multipare, în plină lactație, distribuite aleator in două loturi, conform unui plan experimental în pătrat latin. Au fost testate două rații în care aportul energetic a fost asigurat în principal de amidon (lotul martor) sau de grăsime (lotul experimental). Cele două rații au adus un aport în grăsime de cca 1,6% la martor, respectiv cca 5,6% la rația experimentală, la care semințele de rapiță au fost incluse în proporție de cca 10% din SU.

Rezultatele preliminare au arătat că, pe lângă efectele asupra producției de lapte și a compoziției primare a acestuia, rația experimentală a condus la modificarea profilului acizilor grași din lapte, în sensul scăderii proporției acizilor grași saturați, creșterii proporției acizilor grași polinesaturați, precum și a proporției CLA în cazul rației cu semințe de rapiță. Pe parcursul acestui test au fost prelevate și probele de lapte necesare derulării activităților 3.4 (determinare biomarkeri in lapte) și 3.5. (studiul proteomului laptelui).

 

Activ. 3.2. Analiza markerilor ADN si identificarea taxonilor bacterieni din probele de lichid ruminal

Analiza markerilor ADN si identificarea taxonilor bacterieni a fost realizată pe probele prelevate în cursul experimentului pe batali fistulizați, realizat în etapa anterioară.

Acest experiment a avut la bază aceeași tipologie a rațiilor experimentale utilizate în cadrul experimentului pe vaci de lapte: înlocuirea sursei de energie din nutrețul combinat, fără a modifica substanțial aportul energo-proteic al rației.

Mai concret, o parte din aportul de energie adus de amidonul din cereale a fost înlocuit cu aport de energie adus de uleiul conținut de semințele de rapiță. Practic, cerealele și șroturile din nutrețul combinat au fost parțial înlocuite cu semințe de rapiță. In acest fel, rația martor și rația experimentală au fost izocalorice / izoproteice, dar la rația experimentală a crescut foarte mult aportul de grăsimi. Chiar dacă nu a fost depășită limita admisă, există suspiciunea că acest tip de rație poate induce modificări la nivelul ecosistemului ruminal.

1. a) Izolarea ADN din lichid ruminal

A fost realizată prin metoda optimizată în etapa anterioară a proiectului. Valorile de absorbanță și concentrație obținute în urma verificării spectrofotometrice, au arătat că extracția probelor nu a fost influențată semnificativ de designul experimental. Astfel concentrația (ng/μL) a fost 698.18±328,89 la lotul martor și 724.45±211,82 la lotul experimental, iar raportul A260/A280 a fost de 1.93±0.03 la lotul martor și 1.86±0.04 la lotul experimental.

1. b) Identificarea taxonilor bacterieni prin secvențializare

Probele de ADN extrase au fost amplificate pentru markerii ADN selectați, ampliconii rezultați fiind supuși unei verificări electroforetice. În următoarea etapă, aceştia au fost purificaţi utilizând kitul Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). După purificare, fragmentele de ADN au fost secvențializate prin metoda Sanger, varianta „dye-terminator”. Ampliconii obținuți în timpul acestei reacții au fost supuși unei electroforeze capilare, urmată de o detecție în fluorescență a acestora într-un analizor genetic automat. La finalizarea reacţiei a urmat etapa (obligatorie) de precipitare a produşilor obţinuţi, care s-a realizat cu kitul XTerminator (Life Technologies).Secvențele obținute pentru probele analizate au fost comparate cu cele din GenBank, iar analiza BLAST a confirmat ca acestea aparțin următoarelor clase și genuri: bacterii totale, bacterii metanogene, Ruminococcus sp., Prevotella sp.

 

Activ. 3.3. Analiza prin PCR cantitativ a numărului populațiilor bacteriene din probele de lichid ruminal si a diversității lor

Analiza a fost realizată prin metoda și procedurile optimizate în etapa anterioară a proiectului. Analizele statistice au fost efectuate cu software-ul GraphPad Prism v.6, prin analiza de varianță. S-a observat că modificarea rației a indus modificări ușoare ale microbiotei în cazul exemplarelor analizate. Administrarea rației pe bază de semințe de rapiță a condus la o scădere moderată a abundenței relative a bacteriilor metanogene și bacteriilor totale. În cazul genurilor Prevotella și Ruminoccocus scăderile înregistrate sunt extrem de reduse, nesemnificative din punct de vedere statistic.

 

Activ. 3.4. Estimarea efectelor furajării asupra unor biomarkeri cu relevanță nutrițională

In cursul experimentului pe vaci de lapte, derulat în cadrul activității 3.1., pe lângă probele de lapte pentru determinarea calității laptelui, au fost prelevate probe pentru determinare de biomarkeri din lapte, analize realizate de către partenerul UB. Un prim set de analize, realizată printr-o metoda HPLC optimizată în etapa anterioară, a vizat determinarea concentrațiilor derivaților purinici in cele 60 probe de lapte prelevate: 15 animale / lot * 2 perioade * 2 repetiții. Pentru fiecare din cele 60 de probe au fost realizate câte două determinări, conducând la un total de 120 de valori. Dintre cei cinci derivați purinici prezenți în probele de lapte, doar pentru acidul uric au fost detectate diferențe semnificative între cele două rații. Interpretarea acestor rezultate și corelarea lor cu alte determinări va fi realizată, conform planificării, în etapa următoare a proiectului.

Un alt set de analize a vizat determinarea, prin gaz-cromatografie, a concentrațiilor unor fracțiuni proteice - potențiali biomarkeri, conform aceluiași plan experimental.

Rezultatele preliminare au indicat că între cele două rații nu au fost diferențe semnificative prin prisma concentrației în BSA. Pe de altă parte, s-a înregistrat o scădere a concentrației de α-Lactalbumina, cu 11%, diferență care nu a fost însă detectată ca fiind semnificativă. De asemenea, s-a înregistrat o tendință de creștere a concentrației de β-Lactglobulina B și scădere a concentrației de β-Lactglobulina A. Aceste rezultate vor fi interpretate și corelate cu rezultate obținute din alte determinări în etapa următoare, conform planificării.

 

Activ. 3.5. Estimarea efectelor furajării asupra fracțiunilor proteice din lapte

Efectele rațiilor testate în cadrul Activ. 3.1. asupra fracțiunilor proteice, a fost realizată prin două metode – o metodă semicantitativă (SDS-PAGE), mai accesibilă dar mai puțin precisă, și o metodă cantitativă, de finețe (LC-MS).

1. a) Electroforeza fracțiilor de proteine din lapte utilizând SDS-PAGE

In urma determinărilor s-a observat apariția celor patru cazeine majoritare αs1– cazeina (αs1 – CN), αs2 – cazeina (αs2 – CN), β – cazeina (β – CN) și k – cazeina (k – CN), între aproximativ 20 și 25 kDa și celor două proteine principale din zer β – lactoglobulina (β –Lg) și α – lactalbumina (α – La), aproximativ între 14 și 18 kDa. De asemenea, a fost evidențiată prezența proteinelor minoritare și anume lactoferina (LF), albumina serică bovină (BSA) și imunoglobulina G (IgG), benzi ce apar aproximativ între 50 și 100 kDa.

În urma prelucrării statistice s-au observat modificări semnificative ale acestor fracțiuni, care au rol fie în procesarea laptelui, fie în sănătatea consumatorilor.

1. Determinarea fracțiunilor proteice prin LC/MS

Determinările au fost realizate folosind metodele și procedurile optimizate în etapa anterioară a proiectului. În urma analizei LC-MS/MS au fost identificate 2294 peptide triptice, din cadrul a 246 de proteine, cu o mediană de peste 150 proteine/probă și ~ 1200 peptide triptice/probă. Din punct de vedere calitativ, au fost identificate peptide din fracțiile proteice cele mai abundente din laptele de vacă, precum alfa cazeinele, beta-lactoglobulina, lactotransferina, alfa-lactalbumina, unele serotransferine, precum și unele fracții imunoglobulinice.

Pentru comparația relativă a peptidelor și proteinelor identificate între cele două conții considerate, s-au utilizat valorile cantitative corespunzătoare curenților de ioni specifici peptidelor identificate, într-o primă etapă excluzând peptidele modificate chimic, iar în a doua etapă utilizând doar valorile corespunzătoare fosfopeptidelor identificate. Astfel, valorile curenților de ioni ale peptidelor au fost procesate și asamblate corespunzător fiecărei proteine identificate pentru analiza cantitativă diferențială. Pentru a observa posibile modificări la nivel molecular în cadrul proteomului laptelui de vacă s-a recurs la analiza prin clusterizare ierarhică, metodă ce are la bază clusterizarea tip aglomerativ prin calculul unor distanțe matematice între elementele matricii ce conține datele cantitative. Clusterizarea ierarhică sugerează posibile modificări cantitative la nivelul proteomului între cele două condiții de furajare considerate.

Articole:

Comunicari:

• Comparative proteomics of fresh and frozen bovine milk. The Annual International Conference of the Romanian Society of Biochemistry and Molecular Biology, Bucharest, 5-7th September, 2018. Cristian V.A. Munteanu, Smaranda Toma, Cătălin Dragomir, Ștefana M. Petrescu

 

• Preliminary results on the influence of particular feeding situations on the level of some potential biomarkers in cows' milk. The 33rd EFFoST International Conference: Sustainable Food Systems - Performing by Connecting , Wageningen University & Research , Rotterdam, The Netherlands, 12-14 November 2019. Miuța Filip, Mihaela Vlassa , Irina Ciotlăuș , Ioana Boldea , Cătălin Dragomir.

Altele:
studiu bibliografic

• bază de date
• metode și proceduri analitice optimizate
• acord de transfer tehnologic nr. 5899 / 14.09.2020
• Broșură:

1. Dragomir (2020). Borhotul de bere – valoare nutritivă și particularități

 

Etapa 4 / 2021 – Integrarea si interpretarea rezultatelor; finalizarea diseminarii acestora

In cadrul acestei etape au fost derulate cele doua activitati planificate, in colaborare cu partenerii proiectului component: Universitatea Bucuresti, Universitatea Babes-Bolyai si Institutul de Biochimie al Academiei Romane.

Activitatea 4.6. Raport asupra diseminarii rezultatelor prin articole/comunicari

In cadrul acestei activitati a continuat publicarea / comunicarea rezultatelor prin derularea procesului de reeditare a articolelor in cazul recenziilor favorabile / retrimitere catre alte reviste a articolelor respinse. Dintre cele 5 articole care erau elaborate la 31 decembrie 2020, in perioada 3 ianuarie – 31 mai 2021 au fost acceptate inca doua, iar alte doua articole sunt in curs de elaborare.

Activitatea 4.7. Raport asupra integrarii, interpretarii si diseminarii rezultatelor aplicative

In cadrul acestei activitati a continuat valorificarea datelor experimentale prin realizarea de prelucrari statistice, care au permis validarea efectelor ratiilor studiate asupra diversilor parametri productivi (productia de lapte, procentul de grasime in lapte) sau a unor indicatori care au relevanta prin prisma aplicabilitatii datelor in practica zootehnica sau industria alimentara (ex. fractiuni proteice din lapte, cu relevanta pentru consumatori sau pentru procesatori). O parte dintre retete au fost transmise sectorului de dezvoltare din institut, in vederea includerii lor in portofoliul de produse de uz furajer

Articole:

• Simultaneous quantification of four purine derivatives biomarkers in cow’s milk by using high performance liquid chromatography - diode array detection (HPLC-DAD) and solid-phase extraction (SPE). Mihaela Vlassa, Miuta Filip, Catalin Dragomir. 2020. Czech Journal of Food Sciences, 39, 2021 (2): 122–130

• Fatty acids profile of milk altered by the inclusion of the whole rapeseeds and pumpkin seed cakes in the diets of Murciano Granadina goats. 2021. Ioana Boldea, Catalin Dragomir, Mihai Gras, Mariana Ropota. South African Journal of Animal Science (in curs de publicare)

• # The effects of rapeseeds supplementation on bovine milk protein fractions. Oancea, A.-G, Dragomir, C., Pistol, G.-C., Cismileanu, A., Toma, S. 2020. International Food Research Journal (in curs de publicare)

Comunicari:

• The effects of rapseeds inclusion in the diets of dairy cows on milk quality. Oancea, A.-G., Dragomir, C., Pistol, G.-C., Yaman S., Cismileanu, A. 3rd International Turkic World Congress on Science and Engineering. June 14-15, 2021 (acceptata / inclusa in program)

• The effect of diatery brewers spent yeasts on the quality of sheep milk. Ana Cismileanu, Ioana Boldea, Alexandra-Gabriela Oancea, Catalin Dragomir. 16th International Symposium of Animal Biology and Nutrition, September 30, 2021 (acceptata / inclusa in program)

Altele:

• recomandari nutritionale